在游戲中，其角色陣容包括：遠呂智、妲己、太公望、孫悟空、伏羲、女媧、源義經、平清盛、卑彌呼以及真遠呂智等。

遠呂智：為游戲初始角一。

妲己：同樣為游戲初始角色。

太公望：在蜀傳的“石亭之戰”通關后，玩家便可使用。

孫悟空：則需在魏傳的終章“官渡之戰”通關后解鎖。

伏羲和女媧：分別在戰國章節的“長谷堂之戰”和魏傳的初始關卡中可獲得。

源義經與平清盛：前者在吳傳的第一章“濡須口之戰”通關后可用，后者則在戰國終章的“關原之戰”解鎖。

卑彌呼與真遠呂智：則需在蜀傳的終章“五丈原之戰”和故事模式及戲劇模式全部通關一次后才能使用。

自由模式中可以選擇百百目鬼和牛鬼，這兩位角色在故事模式下也可使用。其中，百百目鬼的獲得條件是獲得任意5個煉成素材，而牛鬼則需要獲得任意25個煉成素材。

值得一提的是，PSP版本的魔王再臨增值版和無雙大蛇Z中加入了三藏法師和并慶這兩個角色，它們在游戲初期即可使用。要在Z中使用他們，前提是已通關無雙大蛇1劇情的所有傳。

以下是一些游戲中的角色別稱及其對應的角色：

一身是膽——趙云，美髯公——關羽，臥龍——諸葛亮，鳳雛——龐統，飛將、人中呂布——呂布，錦馬超——馬超，虎癡——許諸，洛神——甄宓。

惡來——典韋，亂世奸雄——曹操，江東之虎——孫堅，小霸王——孫策。

弓腰姬——孫尚香，碧眼兒——孫權，美周郎——周瑜，大賢良師——張角。

閉月——貂嬋，第六天魔王——織田信長，日本第一兵——真田幸村。

此外還有許多其他角色如伊達政宗、武田信玄、上杉謙信、服部半藏、前田慶次等亦在游戲中有其獨特的別稱。

至于蜀勢力的人物，如劉備、關羽、張飛、諸葛亮、馬超等也是該游戲中的重要角色。吳勢力的周瑜、陸遜、孫尚香等人物也有其獨特的別稱及用途。晉勢力中的司馬懿、司馬師等人同樣不可忽視。戰國時期的真田幸村、織田信長等人物也均有其特殊的地位和作用。

游戲還特別增加了《無雙大蛇2 Special》和《無雙大蛇2 Hyper》中的衍生角色，如蕾切爾和神農，他們分別擁有電鋸和赭鞭，為游戲增添了新的挑戰和樂趣。玩家可以通過完成特定關卡解鎖這些獨特的角色，體驗不同作品的融合魅力。

游戲背景為英雄們為了打倒蛇魔而穿越時空回到過去，登場武將包括《真·三國無雙》系列、《戰國無雙》系列曾經登場過的武將以及曾經在《無雙大蛇》中出現過的武將，人數超過130人。游戲劇情豐富多樣，玩家可以在游戲中體驗到不同時期的戰爭場景和角色性格，是一款非常值得一玩的游戲。